Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish

摘要

Der Zebrabärbling hat sich in den letzten Jahrzehnten als ein beliebter und vielversprechender Modellorganismus herausgestellt. Mit seiner Hilfe werden zunehmend die grundlegenden biologischen Funktionsweisen von Wirbeltieren untersucht und anhand der Erkenntnisse neue Therapien und Medikamente für Krankheiten entwickelt. Zusätzlich hat sich die Verhaltensforschung als Gebiet mit hohem Potential für neue Entdeckungen entpuppt, da es hier möglich ist, deutlich feinere Unterscheidungen und Effekte nachzuvollziehen als es bei stark abgegrenzten Endpunkten wie Verformungen oder Toxizität der Fall ist. Im frühen Stadium bis fünf Tage nach Befruchtung zeigen die Embryonen und Larven des Zebrabärblings einige charakteristische Verhaltensweisen, die durch künstliche Stimulation hervorgerufen werden können. Noch in der Eischale bei einem Alter von nur 30 bis 42 Stunden nach der Befruchtung reagieren die Embryonen auf einen Lichtblitz mit erhöhter Bewegung, der sogenannten Photomotor Response. Bei wiederholtem Belichten bleibt diese Reaktion aus, was als ein typisches Verhaltensmuster interpretiert werden kann. Werden die Embryonen jedoch Chemikalien oder Mutationen ausgesetzt, kann sich dieses Muster verändern und es können Rückschlüsse über die Funktionsweise der verursachenden Methoden gewonnen werden. Als zusätzliche Verhaltensweisen lassen sich die beiden Schreckreaktionen auf Vibration und Berührung nutzen. Bereits in der Eischale lassen sich die Embryonen durch Berührung zum Bewegen bringen. Sobald sie in einem Alter von ca. drei Tagen nach Befruchtung geschlüpft sind, wird die Reaktion als C-Krümmung bezeichnet, da die Larve eine charakteristische Biegung entlang ihrer Körperachse einnimmt bevor sie davonschwimmt. Dasselbe gilt für die Vibrationsreaktion ab einem Alter von ca. fünf Tagen nach Befruchtung. Um diese Verhalten sinnvoll nutzen zu können sind automatisierte Lösungen notwendig, die die Vorbereitung, die Abläufe und die Analyse soweit vereinfachen, dass kaum noch menschliches Eingreifen notwendig ist. Nur so kann der notwendige Durchsatz und die Reproduzierbarkeit gewährleistet werden um statistisch aussagekräftige Effekte nachzuweisen. Aus diesem Grund wurden drei unabhängige mechatronische Systeme entwickelt, die je eines der drei genannten Verhaltensmuster automatisiert auslösen, aufzeichnen und analysieren können. Dazu waren neben der Hard- und Softwareentwicklung auch biologische Vorgehensweisen notwendig um die Systeme zu validieren und sie bereits in ersten biologischen Untersuchungen einzusetzen. Für das PMR System wurde ein hochautomatisierter Versuchsablauf entwickelt, der anhand eines Roboters die Embryonen zur Vorbereitung sortiert und anschließend in einem automatisierten Mikroskop mit vollständig eigenentwickelter Steuerungssoftware die Aufzeichnung der Reaktion gewährleistet. Anschließend können die Rohdaten in Form von Videos automatisiert analysiert werden um numerische Daten aus den Bildreihen zu extrahieren. Das Vibrationssystem umfasst einen neuentwickelten Vibrationserreger in Form eines modifizierten Lautsprechers, der es erlaubt, mehrere Proben parallel zu untersuchen. Dazu wurde der Erreger ausgiebig charakterisiert um zu gewährleisten, dass die erzielten Beschleunigungswerte sowie die Impulsdauer und Frequenz den angestrebten Werten von 14 g, 1 ms und 500 Hz entsprechen. Durch den Einsatz von Beschleunigungssensoren wurden die Erreger kalibriert und die Steuerungssoftware an die Ergebnisse so angepasst, dass ein einheitlicher Effekt zwischen den Erregern gewährleistet ist. Die Implementierung einer Hochgeschwindigkeitskamera erlaubt die Aufzeichnung der Reaktion bei bis zu 1000 Bildern pro Sekunde, was aufgrund der äußerst schnellen Reaktionszeit der Larven im Millisekundenbereich notwendig ist um den vollen Umfang der Reaktion abzubilden. Um Hochdurchsatzversuche zur Berührung der Larven zu ermöglichen, wurde das erste automatisierte System entwickelt, welches durch den Einsatz einer motorisie